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免疫组化常用的染色方法
 

根据标记物的不同分为免疫荧光法,免疫酶标法,亲和组织化学法,后者是以一种物质对某种组织成分具有高度亲合力为基础的检测方法。这种方法敏感性更高,有利于微量抗原(抗体)在细胞或亚细胞水平的定位,其中生物素——抗生物素染色法最常用。

 
免疫组织化学染色方法 IHC染色方法有很多种,按部标记物的性质可分为荧光法(荧光素标记),酶法(辣根过氧化物酶,碱性磷酸酶),免疫金银及铁标记技术等;按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步,三步或多步法);按结合方式可分为抗原-抗体结合,如PAP法和标记的葡聚糖聚合物(labeled dextran polymer,LDP)法,以及亲和连接,如ABC法、标记的链亲和素-生物素(labeled streptoavidin-biotin ,LSAB)法等,其中LSAB是最常用的使用方法。


影响免疫组化染色质量的因素很多,在实验中应注意组织的取材和固定,选择质量好的商品化抗体,恰当的选择和使用封闭和抗原修复手段,严格的技术操作和对照等。由于组织内待测抗原已被分解破坏,或抗原含量过低、或固定剂的使用不当及抗体质量不佳和稀释度不当等可出现假阴性反应;反之,由于抗体与非待检抗原发生交叉反应,或组织对抗体的非特异性吸附及内源性过氧化酶(endogenousperoxidase)没有被阻断等还可出现假阳性结果。这些可造成判断的失误。

 

免疫组织化学染色


SP法
1、脱蜡水化
2、蒸馏水中5分钟
3、用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2室温封闭10分钟蒸馏水洗1次
4、抗原修复
5、PBS洗5分钟
6、滴加正常山羊血清封闭液,室温10分钟
7、甩去多余液体滴加抗371小时或者4过夜4过夜后在37复温45分钟
8、PBS洗2次各5分钟
9、滴加生物素化抗孵育条件参见所用试剂盒
10、PBS洗2次各5分钟
11、滴加酶标抗体孵育条件参见所用试剂盒
12、PBS洗2次各5分钟
13、DAB显色510分钟在显微镜下掌握染色程度
14、蒸馏水洗终止染色苏木素复染盐酸酒精分化
15、脱水透明封片镜检

SABC法
1、脱蜡水化
2、蒸馏水中5分钟
3、用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2室温封闭510分钟蒸馏水洗1次
4、抗原修复
5、PBS洗5分钟
6、滴加正常山羊血清封闭液室温10-20分钟甩去多余液体
7、滴加抗,371小时或者4过夜4过夜后在37复温30分钟
8、PBS洗2次每次5分钟
9、滴加生物素化二抗孵育条件参见所用试剂盒
10、PBC洗2次每次5分钟
11、滴加试剂SABC孵育条件参见所用试剂盒
12、PBS洗2次每次5分钟
13、DAB显色DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色镜下掌握显色程度
14、蒸馏水洗终止染色苏木素复染盐酸酒精分化
15、脱水透明封片镜检

 

 
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